cms rehabilitacja

Wykres pokazuje ilościową analizę immunoblotów. Wszystkie bloty są reprezentatywne dla eksperymentów przeprowadzonych 3 razy. (F) Immunobloty pokazujące poziomy PTP1B w kontrolnych i fibroblastach pochodzących od pacjenta RTT; te same lizaty zastosowano do wymywania dla aktyny kontroli ładowania. Wykres pokazuje ilościową analizę immunoblotów. Wszystkie bloty są reprezentatywne dla eksperymentów przeprowadzonych 3 razy. Myszy z mutacją Mecp2 wyrażały podwyższone poziomy PTP1B. Całkowity RNA wyizolowano z przodomózgowia myszy Mecp2a / y (zerowego) i ich myszy z miotu WT. Nasza analiza ilościowa PCR (qPCR) ujawniła 4 geny, które były regulowane w górę przez więcej niż 1,5-krotne i 5 genów, które były obniżone w szlaku sygnalizacji insuliny u myszy Mecp2y / y w porównaniu z myszami WT (Figura 2A). Ponieważ byliśmy zainteresowani identyfikacją potencjalnych celów terapeutycznych, skupiliśmy naszą uwagę na genach, które uległy zwiększeniu w zwierzętach Mecp2. / Y. Jednym z 4 genów, które uległy zwiększeniu, był Ptpn1, który koduje PTP1B, białkową fosfatazę tyrozynową, która została zwalidowana jako negatywny regulator przekazywania sygnałów w odpowiedzi na insulinę i leptynę (19); w związku z tym sprawdziliśmy, czy PTPN1 był bezpośrednim celem MECP2. Użyliśmy szeregu plazmidów reporterowych, w których ekspresję lucyferazy sterują elementy promotora PTPN1 (23, 24). Po koekspresji plazmidów reporterowych zawierających różne długości sekwencji promotora PTPN1, razem z którąkolwiek z izoform MECP2 (MECP2-E1 i MECP2-E2), zaobserwowaliśmy, że obie izoformy MECP2 tłumiły aktywność promotora PTPN1 (Figura 2B). Ponadto, w przeciwieństwie do WT MECP2, ekspresja MECP2-R168X, istotnego klinicznie mutanta utraty funkcji, nie tłumiła aktywności promotora PTPN1 (Figura 2C i Suplementowa Figura 2C). Dane te sugerują, że PTPN1 był bezpośrednim celem MECP2. Aby potwierdzić, że MECP2 wchodzi w interakcję z promotorem PTPN1, przeprowadziliśmy ChIP i zbadaliśmy kilka genów kodujących znane regulatory sygnalizacji insuliny. Spośród tych genów przetestowanych za pomocą analizy ChIP, zaobserwowaliśmy, że MECP2 wiąże się z promotorem PTPN1 (Suplementowa Figura 2B). Na koniec, w celu ustalenia, czy wzrost mRNA Ptpn1 wykryty przez qPCR był skorelowany z poziomem białka PTP1B u myszy mutujących Mecp2, poddaliśmy równe ilości lizatu z sekcji WT i Mecp2y / mózg do immunoblottingu. Zaobserwowaliśmy, że u samców myszy pozbawionych MECP2 ekspresja białka PTP1B była znacznie podwyższona w porównaniu z poziomami wykrywanymi w ich odpowiednikach WT (Figura 2D). Podobnie ekspresja PTP1B była również wyższa u samic myszy Mecp2a / + (Figura 2E). Ostatecznie, zgodnie z naszą obserwacją u myszy z mutacją MECP2, zaobserwowaliśmy podwyższone poziomy białka PTP1B w fibroblastach pochodzących od pacjentów z RTT (Figura 2F). Dane te ilustrują, że gen PTPN1, kodujący PTP1B, był celem MECP2. CPT157633 i UA0713 selektywnie hamowały PTP1B przez 2 odrębne mechanizmy. W celu określenia znaczenia podwyższonych poziomów PTP1B w zwierzęcych modelach RTT, przetestowaliśmy działanie drobnocząsteczkowych inhibitorów fosfatazy. Przy użyciu fosforanu para-nitro fenylu (pNPP) jako substratu, badaliśmy hamowanie PTP1B przez CPT157633 (Figura 3A i odnośnik 25). Stwierdzono, że związek jest silnym powinowactwem, konkurencyjnym inhibitorem fosfatazy (Figura 3B), ze stałą hamowania (KI) 40 nM. Podobny wynik uzyskano przy użyciu RCML znakowanego 32P jako substratu białkowego (Figura 3C). Ponadto wykazaliśmy, że w porównaniu z PTP1B, CPT157633 był znacząco mniej skuteczny wobec panelu 6 PTP i 2 fosfataz o podwójnej swoistości (Figura 3D), ilustrując swoistość działania inhibitora. Aby uzyskać strukturalne spostrzeżenia na temat interakcji PTP1B-CPT157633, wykorzystaliśmy zarówno biomolekularną spektroskopię NMR, jak i krystalografię rentgenowską.
[przypisy: obliteracja, objawy wirusa hiv, przedszkole nr 9 gdańsk ]