dysfunkcja stawu skroniowo żuchwowego ćwiczenia

(B) Konstrukt targetujący do rekombinacji homologicznej w mysim CACN1S zawierał mutację R528H i ciche miejsce EcoRV. Startery A i B zastosowano do genotypowania i są komplementarne do eksonu 11 z sekwencją intronową. (C) Amplifikacja PCR z genomowego DNA pokazuje amplimer WT o wielkości 500 par zasad i zmutowany 580-bp amplimer z genem NeoR z delecją Cre i retencją krótka intronowa strona LoxP. Prawidłowe wstawienie mutacji R528H potwierdzono przez sekwencjonowanie. Trawienie EcoRV przecinało cały produkt o 580 bp od myszy R528Hm / m, ale nie przecinało amplimeru o wielkości 500 bp z myszy WT lub R528H + / m. (D) Ekspresję WT (+ / +) i R528H RNA określono za pomocą RT-PCR przy użyciu swoistych dla allelu przednich starterów i primera wstecznego z następnego eksonu. Żel agarozowy wykazuje swoistość allelu dla produktu o wielkości 128 bp z tylko primerem R w WT i tylko z primerem H w R528Hm / m. Nowe spostrzeżenia na temat patomechanizmu HypoPP zostały zaczerpnięte z ostatnich prac na podstawie strukturalnej dla bramkowania kanałowego zależnego od napięcia (16, 17). W odpowiedzi na zmiany potencjału błonowego, czujnik napięcia S4 przemieszcza się przez szczelinę lub pory. w białku kanału. Mutacje błędne segmentu S4 mogą wytwarzać prąd przecieku lub bramkowy, który pozwala jonom przejść przez ten nieprawidłowy szlak przewodzenia (18, 19). W oocytach żabich, w których można osiągnąć wysoki poziom ekspresji błony dla NaV1.4, wykryto małe prądy bramkujące dla wszystkich 6 mutacji NaV1,4 HypoPP badanych do tej pory (16, 17, 20, 21). Wykryliśmy również prąd pory bramkowania w napięciowych włóknach mięśniowych z mysiego modelu HypoPP z mutacją NaV1.4 R669H knock-in (22). Prąd upływu przez pory bramkowania w kanałach HypoPP-NaV1.4 jest aktywny w Vrest i wytwarza podatność na paradoksalną depolaryzację Vrest dla K + stężeń poniżej 3 mM przez zależny od K bilans przepływu przez kanał K + rektyfikacji do wewnątrz ( KIR) (11, 23, 24). Homologiczne położenie mutacji missense S4 w CaV1.1 związanych z HypoPP doprowadziło do hipotezy, że anomalny przepływ pory bramkowej jest powszechnym mechanizmem molekularnym, w którym mutacje NaV1,4 lub CaV1.1 mogą powodować HypoPP. Ponieważ CaV1.1 nie wykazuje ekspresji w systemach heterologicznych, nie było wcześniej możliwe eksperymentalne sprawdzenie, czy HypoPP-CaV1.1 rzeczywiście jest spowodowane prądem upływu bramek. Aby stworzyć system, w którym mechanizm molekularny hipowirusa CaV1.1 można by zaadresować eksperymentalnie, opracowaliśmy model mysi wykorzystujący ukierunkowane substytucje missense, CaV1.1 R528H, argininy do histydyny na najbardziej wysuniętej na zewnątrz osadzie czujnika napięciowego S4 w domena II. Myszy mają silny fenotyp HypoPP ze słabością mięśni i paradoksalną depolaryzacją Vrest w odpowiedzi na niskie wyzwanie K +. Ta wbijana mysz CaV1.1 R528H jest jedynym modelem dla HypoPP spowodowanym mutacją CACNA1S, a mutacja R528H jest najczęstszą przyczyną rodzinnego HypoPP u człowieka. Badania zacisków napięciowych izolowanych włókien ujawniły anomalny prąd skierowany do wewnątrz hiperpolaryzowanych potencjałów, a tym samym potwierdził hipotezę, że podatność na HypoPP jest spowodowana przez prądy wylotowe bramek prowadzone przez kanały NaV1.4 lub CaV1.1, w których mutacje missense występują w resztach argininy w S4. czujniki napięciowe. Wyniki Generowanie myszy CaV1.1 R528H. Mutację CaV1.1 R528H związaną z HypoPP u ludzi wprowadzono do mysiego ortologa (mCaV1.1 R528H) przez homologiczną rekombinację w eksonie 11 CACNA1S (Figura 1). Mysie i ludzkie CaV1.1 mają 92% identyczności na poziomie aminokwasowym, a większość różnic znajduje się w końcach karboksylowych. Mutacja R528H znajduje się w domenie czujnika napięcia kanału S4 w drugim powtórzeniu homologicznym, DIIS4 (Figura 1A), które jest identyczne dla 21 z 22 reszt z konserwowaną substytucją leucyny (ludzką) na izoleucynę (mysią) w L535
[podobne: oparzenia pierwsza pomoc, objawy grzybicy pochwy, operacja kręgosłupa szyjnego ]