neurolog opatów

Wszystkie bloty (C. I) są reprezentatywne dla eksperymentów przeprowadzonych 3 razy. W celu określenia, czy TRKB był bezpośrednim substratem PTP1B, badaliśmy, czy zmutowana forma fosfatazy PTP1B-D181A substrat p tworzy stabilny kompleks z TRKB. W przeciwieństwie do enzymu WT PTP1B, który defosforyluje i uwalnia związany substrat, mutant wychwytujący substrat PTP1B-D181A tworzy stabilny kompleks ze związanym substratem, który można wyizolować i scharakteryzować (44). Wytworzyliśmy lizaty mózgu z myszy traktowanych inhibitorem PTP1B i inkubowano równe ilości lizatu ze zmutowanymi formami PTP1B wiążącymi substrat WT lub D181A. Zaobserwowaliśmy, że TRKB tworzy kompleks z mutantem pułapkowym PTP1B-D181A, ale nie z WT, aktywną formą fosfatazy (Figura 6D). Ponadto wstępne traktowanie białka PTP1B nadtlenadanem, które zakłóca aktywne miejsce enzymu, zapobiegło wiązaniu się z TRKB. Dane te są zgodne z tym, że TRKB jest bezpośrednim substratem PTP1B. Nasze poprzednie badania strukturalne podkreśliły znaczenie motywu sekwencji Asp / Glu p-Tyr p-TyrAlg / Lys dla optymalnego rozpoznania substratu przez PTP1B (28). Receptor BDNF TRKB zawiera taki motyw w swojej pętli aktywacyjnej (28); w związku z tym zbadaliśmy specyficzność miejsca działania PTP1B na tym PTK przy użyciu SH-SY5Y jako systemu modelowego. W celu określenia, które miejsca fosforylowania były celem PTP1B, eksprymowaliśmy WT i mutanta (YY705 / 706FF, Y516F i Y815F) formy TRKB w komórkach SH-SY5Y. W odpowiedzi na stymulację BDNF, zauważyliśmy, że nadeksprymowana TRKB była fosforylowana i aktywowana tylko wtedy, gdy miejsca autofosforylacji pętli aktywacyjnej były nienaruszone (Figura 6E). Lizaty z komórek eksprymujących te różne postacie TRKB inkubowano z mutantem pułapkowym PTP1B-D181A, który następnie poddano immunoprecypitacji i monitorowano jego interakcję z TRKB. Stwierdziliśmy, że PTP1B-D181A tworzy stabilny kompleks z WT TRKB w odpowiedzi na stymulację BDNF. Mutacja obu reszt pętli aktywacyjnej Y705 i Y706 do fenyloalaniny (F) w TRKB zniosła tę interakcję (Figura 6F), podczas gdy PTP1B-D181A był zdolny do tworzenia stabilnego kompleksu, gdy reszty Y516 i Y815 były zmutowane do fenyloalaniny (Figura 6F). Łącznie, dane te ustanawiają bezpośrednie oddziaływanie enzym-substrat pomiędzy PTP1B i fosforylowanym TRKB Y705 / 706 (p-Y705 / 706), krytycznymi miejscami autofosforylacji, które pośredniczą w sygnałowaniu indukowanym przez BDNF. Konsekwentnie, traktowanie CPT157633 skutkowało zwiększoną fosforylacją tyrozyny Y705 / Y706 TRKB w mózgu Mecp2 (3 / + (Figura 6G). Przyjrzeliśmy się również statusowi fosforylacji 2 blisko spokrewnionych receptorów TRK TRKA i TRKC w odpowiedzi na traktowanie CPT157633 w lizatach mózgu uzyskanych od myszy Mecp2 (3 (fig. 6, H i I). Co ciekawe, wpływ hamowania PTP1B przez CPT157633 na fosforylację receptorów TRKA lub TRKC był mniej wyraźny niż w przypadku TRKB. Dlatego dane są zgodne z rolą PTP1B jako inhibitora sygnalizacji BDNF / TRKB, którą można przezwyciężyć przez specyficzne małocząsteczkowe inhibitory fosfatazy i sugerują możliwy mechanizm działania PTP, który obserwowaliśmy u myszy RTT. modele. Dyskusja W tym badaniu wykazaliśmy, że MECP2 normalnie hamuje ekspresję białkowej fosfatazy tyrozynowej PTP1B i że rozerwanie MECP2 prowadzi do podwyższonych poziomów tej fosfatazy w modelach RTT. W konsekwencji nadekspresja PTP1B może być specyficznym markerem RTT, co sugeruje, że PTP1B może być idealnym celem terapeutycznym. Wykazaliśmy, że podawanie drobnocząsteczkowych inhibitorów PTP1B radykalnie wydłużyło żywotność samców myszy Mecp2a / y-zero oraz poprawiło neurologiczne i behawioralne objawy samic myszy Mecp2a / + heterozygot, co pokazuje, że zahamowanie fosfatazy doprowadziło do polepszenia niektóre fenotypy w tych modelach RTT
[więcej w: olej z wiesiolka, olx bedzin, oparzenia pierwsza pomoc ]