nomi warszawa bobrowiecka

Wektor celujący skonstruowano w pGKNeoLoxPDt2 i zawierał mutację missenową R528H, transkrypcyjnie ciche miejsce EcoRV do wspomagania genotypowania przez trawienie restrykcyjne i 9,2 kB flankującej sekwencji genomowej. Badania przesiewowe pod kątem rekombinacji w komórkach 129 / SV ES i iniekcji blastocysty przeprowadzono w University of Texas Southwestern Transgenic Core Facility. Założycielki myszy miały wysoki stopień chimeryzmu, a transmisja zarodkowa z prawidłową integracją zmutowanego allelu została potwierdzona przez sekwencjonowanie genomowego DNA. Gen NeoR z intronu w dół od eksonu 11 wycięto przez skrzyżowanie ze szczepem eksprymującym rekombinazę Cre. Genotypowanie przez amplifikację PCR egzonu 11 z DNA z końcówką ogonową pokazało amplimer WT o wielkości 500 par zasad i produkt o wielkości 580 bp ze zmutowanego allelu, który zachował miejsce LoxP i zawierał unikalne miejsce restrykcyjne EcoRV (Figura 1C). W całym tekście mówimy o heterozygotycznych mutantach CACNA1S + / R528H i homozygotycznych CACNA1SR528H / R528H jako myszach R528H + / m i R528Hm / m, odpowiednio. Myszy R528H + / m były żywe, opracowane normalnie, wyhodowane z powodzeniem i utrzymywane były w szczepie 129 / SV z linią z delecją neomycyny. W krzyżówkach z myszami WT, potomstwo po 4 tygodniach było 52% WT i 47% R528H + / m (n = 99). Krzyże między heterozygotycznymi myszami dały żywe homozygotyczne zmutowane potomstwo przy spodziewanej częstotliwości Mendla (R528Hm / m, 26/106). Ekspresję allelu CaV1.1 R528H na poziomie RNA potwierdzono przez syntezę pierwszej nici cDNA z mięśni szkieletowych i amplifikację PCR ze starterami specyficznymi dla allelu (Figura 1D). Startery były komplementarne do sekwencji w eksonie 11 (do przodu, allelu-specyficznym) i eksonie 12 (odwrotnym), które są oddzielone 9 kb sekwencji genomowej, i wytworzyły oczekiwany amplimer 128 bp z matrycy cDNA, tym samym wykluczając możliwość fałszywy sygnał z zanieczyszczenia matrycą genomowego DNA. Amplifikację specyficzną dla allelu pokazano na Figurze 1D, przy czym matryca myszy WT dała produkt tylko wtedy, gdy użyto startera R-R5 (R528); odwrotnie, matryca z mięśnia zmutowanego homozygoty wytworzyła produkt tylko wtedy, gdy użyto startera H w przód (H528). Względne poziomy ekspresji WT i zmutowanych alleli określono na podstawie reakcji PCR z 21 cyklami amplifikacji, znormalizowanymi do amplimeru p-aktyny jako kontrolą jakości matrycy. Względne poziomy transkryptów, w porównaniu z allelem WT u normalnych myszy, wynosiły 0,41 WT / 0,57 R528H (dla myszy R528H + / m) i 0,0 WT / 1,2 R528H (dla myszy R528Hm / m). Myszy R528H są żywe z łagodną słabością kończyny tylnej. Żywotność i przeżywalność myszy R528H + / mi R528Hm / m były nieodróżnialne od myszy WT. Zachowania żywieniowe i przyrost masy w ciągu 4. 52 tygodni były identyczne dla myszy WT i R528H + / m (n = 15. 20, P> 0,3; Suplementowa Figura 1; materiał uzupełniający dostępny online z tym artykułem; doi: 10,1172 / JCI66091DS1). Nie zaobserwowano spontanicznych ataków paraliżu myszy R528H + / m lub R528Hm / m, a aktywność lokomotoryczna obserwowana w ciągu dnia była nieodróżnialna od aktywności myszy WT. Badanie ilościowe siły chwytu wykazało 15% zmniejszenie siły tylnej w przypadku myszy R528H + / m od 3 do 8 miesięcy (n = 11, P <0,01, Figura 2A). Zmniejszona siła przyczepności dla samców myszy R528H + / m nie progresywnie pogarszała się z wiekiem. Nie zaobserwowano różnic w sile przyczepności w kończynach przednich ani u samic myszy R528H + / m. Maksymalną siłę skurczu oceniano mierząc napięcie izometryczne podczas stymulacji tężcowej in vitro. Mięsień prostownika długiego (EDL) z kończyny tylnej wyizolowano z 6-miesięcznych myszy i utrzymywano w 37 ° C. Skurcze tężcowe zostały wywołane przez stymulację polową równoległymi elektrodami drutowymi (impulsy 1-ms, 250 Hz, n = 30), a kurary (0,25 M M) dodano do blokowania transmisji nerwowo-mięśniowej od aktywacji gałęzi końcowych neuronów ruchowych [przypisy: orzechy włoskie kalorie, omega kleszczów, olx bedzin ]